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摘要 为建立一种新的SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR方法 ,使之能够有效消除引物二聚体 (PDs)对实时定量结果的影响 .对RT PCR特异性扩增产物和PDs分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析 .依据PDs和扩增产物的熔解温度 (Tm)特点 ,在通用的三步法的延伸步骤之后 ,增加一个短暂的 (5s)恒温和荧光检测步骤 ,使这个步骤的温度高于PDs的Tm,但低于扩增产物的Tm,简称该法为四...
摘要 建立竞争性 PCR方法 ,以期用于转录水平基因表达的定量研究 .以检测大鼠颅骨骨细胞总RNA中骨形态发生蛋白 - 2 ( BMP- 2 ,bone morphogenetic protein- 2 ) m RNA含量为例 ,构建大鼠BMP- 2基因的竞争模板 ,以之为内对照进行竞争性 PCR.PCR反应结束后 ,电泳、拍照 ,扫描所扩增条带密度 ,作回归方程 .根据回归方程 ,计算出正常 7...
RT-PCR法扩增的人溶菌酶cDNA的克隆及其核苷酸顺序分析
胎盘 溶菌酶 逆转录-聚合酶链反应 分子克隆 核苷酸顺序
2007/12/19
摘要 本文以人胎盘全RNA为底物进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),制备出了人溶菌酶的cDNA片段。在限制性内切酶Sma Ⅰ存在的连接体系内,将此cDNA克隆入载体pUC12的Sma Ⅰ位点。用重组质粒双链DNA的末端终止法测定了其全部的核苷酸顺序,证明其全长为444bp,编码了18个氨基酸的信号肽和130个氨基酸的成熟蛋白组成的溶菌酶的前体蛋白,并证明已成功地在此cDNA的3′末端导入了两...
RT-PCR测定组织纤溶酶原激活剂突变体(La-tPA)在转基因鼠乳腺表达的研究
La-tPA 转基因鼠 RT-PCR 乳腺表达
2007/12/19
摘要 利用所构建的乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体(La-tPA)载体.对540枚小鼠受精卵进行显微注射,经PCP和Southernblot检测,获得6只整合有人La-tPA转基因小鼠.为了精确研究转基因在小鼠体内的表达,采用RT-PCP方法测定转基因鼠在泌乳期1~20dLa-tPA基因的转录,结果表明,在转基因鼠乳腺的La-tPAmRNA水平在10~15d最高,在20d时降为最低.外源基因在转基...
摘要 用自行设计的TaqMan双标探针和扩增引物建立检测鸟苷酸结合蛋白(G-protein)mRNA的实时荧光定量RT-PCR技术.用G蛋白纯品绘制定量标准曲线,实时荧光定量PCR仪检测ECV304细胞和小鼠G蛋白mRNA水平.10μmol/LGqαmRNA反义寡核苷酸(GqαODN)作用ECV304细胞24h后,Gqα的mRNA表达显著下降(3.18×108±1.75×108拷贝下降到1.44×...
LDL受体基因cDNA的RT-PCR分离、克隆及其在RFLP中的应用
RFLP
2007/12/17
摘要 利用RT-PCR技术分离低密度脂蛋白受体基因cDNA,将长为2605bp的cDNA插入质粒pJN6,并经全序列测定证实,该序列与已报道序列相比,存在两个变异碱基,即第754位C→T,和1654位的G→A,这两个变异碱基并不改变编码的氨基酸,利用LDL受体基因cDNA中的ClaⅠ片段作为探针,检测到LDL受体基因上外显子8的StuⅠ位点是个限制性片段长度多态性位点。所克隆的cDNA含有可译框架...